了解遠場校正物鏡分辨能力與放大率

在光學工業中，顯微鏡一般用于機器視覺和生命科學，或生物和應用上。機器視覺應用可支持半導體、電子產品、裝配，以及制造市場等。而生命科學應用則可用于以不同的物鏡放大率，來觀察細胞或生物樣本。若要了解分辨能力、放大率和生命科學其他一般的物鏡規格之間的相互作用，那就必須考慮到無限遠校正物鏡如何以5x、10X、20X和50X的放大率對皮膚細胞培養進行成像。

以下章節中的4個詳細應用范例使用了愛特蒙特光學的無限遠校正物鏡。 其中，Mitutoyo物鏡更可進行替換。盡管Mitutoyo物鏡與機器視覺以及工業檢測相同，但它們卻可在光線偏低的環境里，以及那些于細胞和微型檢測的應用中，發揮出的效果。

物鏡主要術語

不論放大率為多少，無限遠校正物鏡都能很好地進行成像。它們非常適用于那些要求高度以及在把濾光片、分光鏡、棱鏡和同軸照明組件加入到光路當中時具有模塊化功能的應用。但是，使用無限遠校正物鏡時，必須在以下幾個方面進行權衡：

1）較高的放大率可產生較高的數值孔徑，但工作距離卻會因此變短，特定視場范圍則變得更小。

2）較低的放大率可產生較低的數值孔徑，但工作距離卻會因此變長，特定視場范圍則變得更大。

3）分辨率由放大率所控制，因此兩者將會相對增加。

放大率、數值孔徑、工作距離和分辨率皆與無限遠校正物鏡息息相關。放大率是通過以物鏡焦距除以管透鏡焦距而取得的。數值孔徑(NA)則是入射瞳孔直徑焦距的一項功能，它可影響進入到無限遠校正系統的光量。工作距離(WD)由物鏡光路的齊焦距離所決定；它是正面光學元件與受檢測物體之間的距離。而分辨能力則是難以清楚解釋的規格。由于難以在特定放大率下觀察實物在進行檢測時的情況，并將分辨能力量化，因此好的方法便是查閱以下章節中的應用范例。有關物鏡主要術語的其他信息，請參閱“了解顯微鏡與物鏡”。

應用范例

遠場校正物鏡系統應用非常廣泛。就生物應用而言，為普遍的便是熒光顯微鏡。其中包括基本的熒光檢測系統，乃具有更精密的共焦系統與多光子的熒光系統。為復雜的熒光系統擁有高放大率、精密機械、高質量的濾光片以及強大的光源，例如激光。而較為簡單的系統則使用一般的寬帶光源、基本的濾光片、簡單的機械，以及按受檢測樣本而定的放大率。

低放大率的皮膚細胞培養成像

遠場校正物鏡必須根據幾條守則，并按被測標本來作出選擇。一般上，細胞的大小為10μm。許多低放大率和分辨率的物鏡都適用于細胞群的成像。如果需要區分細胞膜或細胞內的組成部分，譬如線粒體、核糖體或細胞核，則1μm或以下的分辨率為理想。

在圖1-4中，所用于檢測的樣本為具有三色染色的“三維皮膚細胞培養模型”。此樣本由位于美國北卡羅來納三角研究園(Research Triangle Park)的Zen-Bio所培養與制備。在圖1中，可清楚看 到細胞成分被細胞外基質(ECM)所包圍。細胞外基質可將組織集合起來。它的內部具有間質性基質和基底膜，用于存貯多糖和纖維蛋白，以作為對抗外壓的壓縮緩沖。在基底膜里存有被上皮細胞間隔，層層相疊的膜片。要清楚看到多糖凝膠和上皮細胞，好的方法就是使用高放大率的無限遠校正物鏡。藍色的部分是組織基質，而紫色的部分則是細胞和細胞膜。每一個細胞中都有一個含有白色和部分紅色的小區域，標示著密集的細胞間物質，例如線粒體及細胞核。

圖1由#59-876 5X M Plan Apo物鏡采集而成。此無限遠校正物鏡具有0.14的數值孔徑、1.28mm x 0.96mm特定視場范圍的½"傳感器，以及2μm的分辨能力。由于人體細胞的大小通常為10μm 左右，因此，#59-876物鏡的規格是用于觀察人體細胞的理想選擇。

圖1：在#59-876物鏡及5X放大率下的組織樣本三色染色

圖2由#59-877 10X M Plan Apo物鏡采集而成。它具有0.28的數值孔徑、0.64mm x 0.48mm特定視場范圍的½"傳感器，以及1μm的分辨能力。在這一圖片中，可清楚看到ECM的堆疊與編織以及間質結構。此外，細胞膜也清晰可見。細胞的中心位置還有一些細胞內結構，例如核糖體、線粒體以及一個大細胞核。

圖2： 在#59-878物鏡及10X放大率下的組織樣本三色染色

高放大率的皮膚細胞培養成像

圖3由#59-878 20X M PlanApo物鏡采集而成。 此無限遠校正物鏡具有0.42的數值孔徑、 0.32mm x 0.24mm特定視場范圍的½"傳感器，以及0.7μm的分辨能力。圖3在的特 定視場范圍內呈現出整個細胞。周圍的細胞外基質得到更精細的區分，而細胞內分子則比圖1或圖2的來得更大、更清晰。

圖3： 在#59-878物鏡及20X放大率下的組織樣本三色染色

圖4展示50X放大率的物鏡。高放大率可在不需經過任何機械過程，或利用壓電致動器來穩定遠場校正物鏡和圖像平面的情況下達到。在這一放大率下，照明器或計算機風扇的輕微震動可導致視頻饋送發生極大的晃動并且無法對焦。圖4由#59-879 50X M Plan Apo物鏡采集而成。 它具有0.55的數值孔徑、0.128mm x 0.096mm特定視場范圍的½"傳感器，以及0.5μm的分辨 能力。此物鏡的焦點深度為0.9μm。因此，不使用適當的機械裝置將會導致對焦變得冗長繁瑣。對比圖5X、10X與20X的圖像，圖4中的細胞膜和細胞內成分顯得格外清晰及有活力。此外，細胞組成部分的大小與形狀也變得更加明顯可見。比較圖1（5X放大率）和圖4（50X放大率），放大率的增加顯而易見。分辨能力提高了4倍，而特定視場范圍則縮小了20倍。利用50X放大率進行成像時，必須采用高強度、高對比度的光源，以提高照明度并數字化調節快門和增益。數字設置可設定為自動的暗度和幀速率補償。對于組裝數字視頻顯微鏡而言，這是一項極為有用的功能。有關使用現成組件來組裝數字視頻顯微鏡的其他信息，請參閱“數字視頻顯微鏡的物鏡設置”。

圖4：在#59-879物鏡及50X放大率下的組織樣本三色染色

遠場校正物鏡是用于機器視覺和生命科學應用的理想物鏡。在進行組織等生物樣本的成像時，對不同物鏡放大率的效果的了解是極其重要的。5X和10X的物鏡適用于觀察細胞群與細胞外基質內的細微結構。而20X和50X的物鏡則可產生更大的分辨率，并可用于觀察細胞內分子。